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16S rRNA基因测序，或简称16S测序，利用PCR靶向和扩增细菌16S rRNA基因¹的高变区（V1-V9）的部分。然后，将来自单独样品的扩增子给予分子条形码，将其合并在一起并进行测序。测序后，将使用生物信息学管道分析原始数据，包括修剪，纠错和与16S参考数据库的比较。在将读段分配到系统发育等级后，可以生成分类概况。同样，ITS测序遵循相同的策略，但靶向真菌基因组中的ITS（内部转录间隔区）区域。

与仅靶向16S rRNA基因的16S测序不同，shot弹枪宏基因组测序序列均从样品中获得了基因组DNA。文库制备工作流程类似于常规的全基因组测序，包括随机片段化和衔接子连接。shot弹枪宏基因组数据分类学分析的典型工作流程包括质量修整和与包含完整基因组（例如Kraken ²和Centrifuge ³）或选定标记基因（MetaPhlAn ⁴和mOTU ⁵）的参考数据库进行比较。）以生成分类资料。由于shot弹枪宏基因组测序涵盖了样品中的所有遗传信息，因此该数据可用于其他分析，例如宏基因组装配和分箱，代谢功能分析以及抗生素抗性基因分析。

16S测序还是shot弹枪测序？几乎所有微生物组研究人员在计划一项新研究时都会问这个问题，因为绝大多数微生物组出版物都利用16S rRNA基因测序或shot弹枪宏基因组测序来生成原始数据，用于后续的微生物谱分析或宏基因组学分析。每种方法都有其优缺点。

简而言之，转化就是通过从环境中吸收外来DNA来改变细胞遗传密码的过程。质粒转化用于描述质粒在细菌之间的（非病毒）水平基因转移。尽管转化可能发生在自然界中，但科学家已利用这一过程达到了自己的目的，从而能够复制实验室操作的质粒并表达所需的重组DNA序列。

这个过程比较简单；科学家通过化学手段或电刺激使细菌细胞的膜对DNA具有渗透性。这些被称为“感受态细胞”的细胞将很容易从周围环境中摄取质粒DNA。一旦将感兴趣的DNA分子引入这些感受态细胞，细菌便已被质粒转化。然后可以通过包含抗生素以杀死未转化的细胞而从未转化的细胞中选择转化的细胞。通常，这是由于质粒将表达抗生素抗性基因来保护转化的细胞并确保质粒随时间和细胞分裂的维持而发生的。在此过程中，将创建质粒的许多复制子并将其传递给子细胞。

转染是质粒转化的一种类型，通常是动物细胞而不是细菌的转化。这个过程比常规的转换要复杂一些，因为许多实验室培养的真核细胞不能自然地吸收和复制外源DNA。尽管如此，科学家们发现了将质粒和其他外源DNA引入细胞的许多方法。

与细菌的方法非常相似，有化学和物理两种转染方法，可在细胞膜上产生瞬时孔并吸收外源DNA。这些方法的作用与概述的细菌转化方法相似，因为它们都旨在使细胞膜更具渗透性。但是，它们使用的方法不同于细菌，而是使用阳离子脂质，胶束，激光甚至是粒子枪来进行。这些方法各有利弊，但最终将取决于可用资源和研究人员的偏好。

转染成功与否很大程度上取决于质粒DNA的纯度和质量。以下是确保成功转染的四个要点。

1.质粒DNA应该主要是超螺旋的，并且没有基因组DNA和RNA。

2.质粒DNA应高度浓缩，并且不含酚，盐和蛋白质。

3.质粒DNA应不含内毒素。

4.质粒DNA应该是正确的序列。

从孢子中分离DNA的方案

ZymoBIOMICS DNA Miniprep的高密度珠粒配方（0.1和0.5 mm）可有效溶解带有高和低速干扰物的枯草芽孢杆菌内生孢子，表明试剂盒的多功能性。此外，通过接种孢子裂解物测定，裂解效率被确定为大于99％（图4）。裂解后铺板的活菌落形成单位的数量极少，等于不可回收DNA的皮克，这表明使用高密度BashingBeads™（0.1和0.5 mm）进行裂解的效率接近100％。

如何从孢子中提取DNA的方案：

1、将内生孢子样品/包含内生孢子的样品添加到ZR BashingBead裂解管中。

2、在样品管中加入750 uL DNA / RNA Shield或ZymoBIOMICS裂解液，并盖紧瓶盖。

3、用经过验证的方法彻底裂解包括孢子在内的微生物的珠子样品：

低速：Vortex-Genie®

将管子放在水平管子适配器上

以最高速度打开Vortex-Genie®

敲打40分钟（20分钟足以进行孢子裂解，但是40分钟将确保用于宏基因组学研究的微生物完全裂解）

高速：Fastprep-24™

将试管放在搅拌器中并固定

珠子以最大速度（6.5 m / s）跳动1分钟

让样品静置5分钟。休息不足会导致系统错误。

重复5次，总共5分钟的磁珠跳动

4、以> 10,000 g旋转样品1分钟

5、使用ZymoBIOMICS DNA试剂盒处理上清液

应使用Ab260 nm 1.0 = 40 µg / ml的紫外分光光度计（NanoDrop）将转化的DNA定量为RNA。在确定亚硫酸氢盐转化的DNA的回收率时，需要考虑两个主要因素：1.）原材料的完整性，以及2.）RNA污染。在评估回收率时，最重要的因素是DNA的质量（以大小计），用作亚硫酸氢盐转化的输入。降解的原料将导致亚硫酸氢盐转化过程中样品损失的增加。此外，RNA污染将对Ab260 nm产生重大影响，从而导致DNA量的高估。携带进转化中的RNA丢失了，从而使产量与输入相比显得较低。重要的是，在以上两种情况下，转换都不会受到影响。